產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
HIS2作為報(bào)告基因時(shí)，會(huì)有一定程度的泄漏性表達(dá)，出現(xiàn)背景過(guò)高的現(xiàn)象，一般稱作自激活。這時(shí)可以在篩選培養(yǎng)基中加入適量的HIS2競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑3-AT（3-amino-1,2,4-triazole），以降低背景；或者增加一個(gè)篩選標(biāo)記Ade來(lái)進(jìn)行更加嚴(yán)格的篩選。加入的3-AT濃度過(guò)高，蛋白間比較弱的相互作用也可能被抑制，因此需要篩選確定3-AT的最適濃度。
本公司的3-AT溶液為經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌的即用型母液，用于酵母雜交實(shí)驗(yàn)抑制本底表達(dá)，用以準(zhǔn)確篩選出蛋白互作引發(fā)的His的報(bào)告基因的表達(dá)。
使用方法:
1.計(jì)算所需平板的數(shù)量，計(jì)算配置培養(yǎng)基體積；
2.設(shè)置3-AT的濃度梯度（建議10-50 mM 的濃度范圍設(shè)3-5個(gè)梯度，常用濃度約30 mM）；
3.滅菌篩選培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻到55 ℃左右，加入3-AT母液，搖勻后倒板；
4.標(biāo)記每個(gè)平板的3-AT濃度，超凈臺(tái)冷卻凝膠后，按單位面積單個(gè)克隆計(jì)算培養(yǎng)物濃度，涂板；
5.28-30 ℃培養(yǎng)3-5天，篩選出最佳3-AT濃度，用于后期互做篩選。
儲(chǔ)存條件:
1.理想情況10 mM濃度的3-AT平板會(huì)有少量生長(zhǎng)，20 mM濃度的3-AT不能或極少生長(zhǎng)。如果在80 mM濃度的3-AT平板上生長(zhǎng)酵母，說(shuō)明自激活活性太高，不能用于雙雜交篩選。
2.誘餌蛋白能夠單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)，該蛋白如果是具有轉(zhuǎn)錄激活域一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，需要去掉轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。如果不是轉(zhuǎn)錄因子但仍具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性，需要將誘餌蛋白具有激活活性的區(qū)域去除，但這樣操作有可能影響蛋白間的互作。
儲(chǔ)存條件:
-20 ℃儲(chǔ)存，有效期24個(gè)月。
